Danh mục các Đối tượng Kiểm dịch thực vật và các sinh vật hại tiềm ẩn đã phát hiện
được trên giống cây có múi nhập khẩu.
3.2.7. Kết luận.
1) Tình hình dịch hại
2) Xử lý lô giống.
3) Cấp giấy chứng nhận Kiểm dịch thực vật Sau nhập khẩu (nếu đủ điều kiện).
PHỤ LỤC:
KIỂM DỊCH THỰC VẬT SAU NHẬP KHẨU
1. Kiểm tra Kiểm dịch Sau nhập khẩu.
Bảng 1. Các phương pháp kiểm tra.
Phản ứng chuỗi Polymerasa Sử dụng chẩn đoán một số loại bệnh
ẩn.
Men liên kết miễn dịch Virus tàn lụi cam quýt (Citrus tristeza
closterovirus)
Xylella fastidiosa
Spiroplasma citri
Virus lùn Satsuma (Satsuma dwarf
ilarvirus)
Virus nhỏ lá cam quýt (Citrus tatter
leaf capillovirus)
Chỉ thị sinh học
Các loài Các giống cây chỉ thị
Citrus sinensis
Cam Tổ hợp Virus bệnh đốm (Psorosis
complex)
Spiroplasma citri
Liberobacter asiaticum
Liberobacter africanum
Citrus limon
Chanh Eureka Virus tàn lụi cam quýt (Citrus tristeza
closterovirus)
Virus quăn lá cam quýt (Citrus leaf
rugose virus)
Virus khảm lá (Citrus variegation
ilarvirus)
Citrus medica L.
Chanh Yên
Viroid vẩy vỏ (Citrus exocortis
viroid)
Citrus aurantifolia
Chanh Tây ấn Virus tàn lụi cam quýt (Citrus tristeza
closterovirus)
Virus biến dạng gân lá (Citrus
veinenation virus)
Poncirus trifoliata X
C. sinensis
Chanh ba lá hoặc quất
Swingle
Bệnh nhỏ lá cam quýt (Citrus tatter
leaf capillovirus)
1.1. Phương pháp PCR.
Mỗi loài sinh vật có cấu trúc DNA khác nhau và trong cùng một giống giữa các loài cũng
có sự khác nhau. Trong một giống, DNA của các loài có những đoạn cấu trúc giống nhau,
nhưng có những đoạn có cấu trúc khác nhau mà cấu trúc này đặc trưng cho loài này mà
những loài khác không có. Đây là cơ sở di truyền để phân biệt giữa loài này và loài khác.
Phương pháp PCR chính là nhằm nhân lên gấp bội số lượng các đoạn DNA đặc trưng để
từ đó có thể chẩn đoán chính xác được các loài.
1.2. Phương pháp ELISA.
Kỹ thuật này cơ bản được dựa trên sự kết hợp giữa men với các kháng thể hoặc kháng
nguyên thành vật đánh dấu men sau đó chúng lại có phản ứng với kháng nguyên hoặc
kháng thể tương ứng thành hợp chất miễn dịch của men đánh dấu. Men kết hợp tại hợp
chất miễn dịch khi gặp chất đệm sẽ thúc đẩy phản ứng thuỷ phân chất đệm tạo ra màu
vàng. Tốc độ của phản ứng thuỷ phân càng nhanh, màu vàng càng rõ, chứng tỏ men càng
nhiều, điều này cũng chứng tỏ nồng độ của kháng nguyên càng cao. Do tính đặc hiệu của
phản ứng ELISA ta có thể xác định được đặc tính của kháng nguyên.
Bộ Kit để kiểm tra có thể sử dụng cho các bệnh sau:
- Xylella fastidiosa
- Spiroplasma citri
- Lùn Satsuma (Satsuma dwarf ilarvirus)
- Tàn lụi cây có múi (Citrus tristeza closterovirus)
- Virus nhỏ lá cây có múi (Citrus tatter leaf cappillovirus)
1.3 Chỉ thị sinh học
Dùng cây chỉ thị để xác định những bệnh ẩn của cây có múi ở hai mức nhiệt độ:
* Nhiệt độ 18 - 25oC (tốt nhất là 20 - 22 oC) cho các tác nhân gây bệnh sau:
- Virus tàn lụi cây có múi (Viruses Citrus tristeza closterovirus)
- Virus biến dạng gân lá cây có múi (Citrus veinenation virus)
- Virus khảm lá (Citrus varegation ilarvirus)
- Vius quăn lá cây có múi (Citrus leaf rugose virus)
- Virus bé lá cây có múi (Citrus tatter leaf capillovirus)
* Nhiệt độ 25 - 35oC (tốt nhất là 30 - 35 oC) cho tác nhân gây bệnh:
- Viroid vảy vỏ cây có múi (citrus exocortis viroid)
- Viroid mạch dẫn cây có múi (citrus cachexia viroid)
- Spiroplasma citri
- Liberobacter asiaticum
- Liberobacter africanum
Bảng 1.3.1 Số cây chỉ thị cần nhân giống.
Dải nhiệt độ Cây chỉ thị Số chậu
((15cm)
Số cây trong
chậu
Lạnh 18-25oC Cam ngọt 3 5
Chanh Eureka 2 5
Chanh Tây ấn 2 5
Chanh Rusk 2 5
Nóng 25-35oC Cam ngọt 3 5
Chanh yên 2 2
Bảng 1.3.2. Cây chỉ thị dùng cho việc kiểm tra bệnh.
Bệnh Cây chỉ thị thích hợp Cây chỉ thị khác
Bảng 1.3.2. Cây chỉ thị dùng cho việc kiểm tra bệnh.
Bệnh Cây chỉ thị thích hợp Cây chỉ thị khác
Cachexia (Xyloporosis) Chanh yên - Chanh sần
- Poncirus trifoliata
Virus quăn lá (Citrus leaf
rugose)
Chanh Tây ấn
- Citrus limon
- Bưởi đỏ Duncan
Virus khảm lá (Citrus
variegation)
Chanh yên Đậu tương và đậu đen
Giòn lá (Crinkly leaf) Chanh Eureka -
Cristacortis Cam ngọt - Quýt Orlando
- Cam chua
Vảy vỏ (Exocortis) Chanh yên Chanh sần
Greening and Dieback
Cam ngọt - Quýt Sexton
- Bưởi Duncan
Impietratura Cam ngọt Bưởi
Tổ hợp bệnh đốm Virus
(Psorosis complex)
Cam ngọt - Quýt Homosassa, Emperor
- Chanh Tây ấn
Đốm vòng dòngB (Ringspot
(Psorosis B ))
Cam ngọt -
Lùn Satsuma (Satsuma dwarf) - Quýt Satsuma
- Sesamum indicum
Stubborn Cam ngọt - Quất Sexton
- Bưởi Duncan
Nhỏ lá/Lùn cây (Tatter leaf/
stunt)
Chanh ba lá và quất
Swingle
- Chanh Troyer
- Đậu đen (Vigna cilindrica)
- Citrus excelsa
- Nicotiana clevelandii
Hai chủng tàn lụi cam quýt
(Tristeza - stem pitting and
seedling yellows)
Chanh Tây ấn
Chanh Eureka
Chanh Mexica
- Cam đắng ngọt Seville
- Cam chua (Citrus aurantium)
Biến dạng gân/U thân gỗ (Vein
enation/ woody Gall)
Chanh Tây ấn Chanh sần
Bảng 1.3.3. Triệu chứng bệnh trên cây chỉ thị
Dải
nhi
ệt
độ
Bệnh Cam
ngọt
Chanh
Eurek
a
Chanh
Tây ấn
Chanh
ba lá,
hoặc
quýt
Chanh
yên
Quăn lá
(Citrus leaf rugose)
CF LP
Biến dạng gân lá
(Citrus variegation)
AS
Giòn lá (Crinkly leaf) AS LP
Cristacortis OL
Impietratura OL
Lạnh Đốm lá dòng A
(Psorosis A)
CF
Đốm lá dòng B
(Psorosis B)
OL
Nhỏ lá/lùn (Tatter leaf /
stunt)
CM &S
Đốm tàn lụi (Tristeza –
stempitting)
CVF&WP
Vàng tàn lụi (Tristeza –
yellows)
LY & S
Biến dạng/u thân gỗ
(Veinenation / woody
gall)
VE
Exocortis LE
Nóng Greening and dieback VY &
LM
Stubborn CM
AS - Asteroid spots (đốm dạng sao) CF - Chlorotic flecks (đốm vàng)
CM - Chlorotic mottling (đốm mất màu) CVF - Chlorotic vein flecking (đốm màu
vàng gân)
LE - Leaf epinasty LM - Leaf mottle (đốm lá)
LP - Leaf puckering (nhăn lá) LY - Leaf yellowing (vàng lá)
OL - Oak leaf pattern (dải sùi lá) S - Stunting (lùn cây)
VE - Veinenation (biến dạng gân) VY - Vein yellowing (vàng gân)
WP - Wood pitting (Đốm thân gỗ)
2. Nhân giống, chăm sóc và bảo quản tại cơ sở Sau nhập khẩu.
2.1. Nhân gốc ghép và cây chỉ thị.
Các hạt được gieo để làm cây chỉ thị sinh học hoặc gốc ghép được lấy từ các cơ sở sạch
bệnh có uy tín, các hạt này đem gieo trong khay và để ở nhiệt độ 20 - 25oC. Cây chỉ thị
là chanh yên (Citrus medica L.) được nhân giống từ cành ở nhiệt độ 30 - 35oC. Cây được
trồng trong hỗn hợp chất độn (của Trường Đại học California) theo tỷ lệ thể tích phù hợp
gồm: 1 than bùn : 1 cát hoặc bột đá và phân vô cơ được tiệt trùng theo phương pháp
Paster (ở 60oC trong 30 phút) có thể thêm vào nhiều nhất 10% vỏ trấu (tính theo thể
tích).
Trước khi sử dụng làm cây chỉ thị hoặc gốc ghép không bón thúc cho cây. Sau đó chuyển
chúng vào chậu hoặc túi nilon có chứa 250 – 300g hỗn hợp chất nền theo công thức của
Trường Đại học California. Nếu cây biểu hiện triệu chứng thiếu dinh dưỡng thì sẽ bón bổ
sung bằng hỗn hợp chất độn với tỷ lệ 1 máu khô và bột xương: 1 Dolomit. Sau đưa cây
được ghép trồng trong điều kiện nhiệt độ 30 - 35oC.
2.2. Nhân giống từ mắt ghép.
Hai cây được nhân giống từ mắt ghép trên gốc chanh Sần. Ba đến bốn tuần sau khi ghép
mắt, cắt các chồi nách của chanh sần để tập trung cho mắt ghép phát triển.
Chọn một cây làm cây chỉ thị. Nếu cần thì tiến hành ghép đỉnh sinh trưởng. Cây con được
nhân lên từ cây chỉ thị sẽ được trả lại cho chủ hàng.
2.3. Phòng trừ dịch hại.
Sử dụng thuốc hoá học, dầu thực vật và thuốc sinh học để phòng trừ sinh vật hại trong
nhà kính. Các sinh vật hại thường có nhện hai chấm, nhện to bụng, rệp phấn, rệp sáp. Chú
ý rệp muội đen trên cây có múi phải được sớm diệt trừ triệt để nhằm ngăn chặn việc
truyền Virus.
3. Loại bỏ các tác nhân gây bệnh và nhân giống.
Ghép đỉnh sinh trưởng là kỹ thuật nhân dòng các giống cây có múi đã được loại bỏ bệnh,
cùng với khả năng tạo ra những dòng mới sạch Virus và các tác nhân gây bệnh khác. Tất
cả cây có múi mới phải được ghép đỉnh sinh trưởng ít nhất một lần trước khi xuất ra khỏi
cơ sở Kiểm dịch Sau nhập khẩu. Điều này có nghĩa là đảm bảo sạch Xanthomonas
campestris pv. citrumelo, phytoplasma, Viroid và Virus. Các bước kiểm tra được làm
nhiều lần đến khi cho kết quả kiểm tra khẳng định là sạch bệnh. Những gốc ghép được
sản xuất từ các tổ chức trên thế giới có chứng nhận đạt tiêu chuẩn thì không cần phải
ghép lại ở Việt Nam.
3.1. Mắt ghép dùng ghép đỉnh sinh trưởng.
Việc ghép đỉnh sinh trưởng được thực hiện ngay lập tức khi có mắt ghép thích hợp được
đưa tới.
Nếu có chồi ghép mới nhập không thích hợp cho việc ghép ban đầu các mắt ghép được
ghép vào thân một cây mẹ và sau đó chọn mắt ghép và thời điểm thích hợp nhất để tiến
hành ghép.
3.2. Xử lý mắt ghép để ghép đỉnh sinh trưởng.
Tiệt trùng bề mặt mắt ghép trước khi bắt đầu ghép. Nhúng mắt ghép trong dung dịch
Ethanol 70 % trong 2 phút, sau đó nhúng trong dung dịch Clorin (Clo) 0,2% hoặc Sodium
hypochrorite trong 10 phút. Bảo quản mắt ghép ở nhiệt độ 26oC trong cát ẩm đã tiệt
trùng với chu kỳ chiếu sáng 16 giờ đến khi đem ra sử dụng.
3.3. Sản xuất gốc ghép để ghép đỉnh sinh trưởng.
Sử dụng chanh ba lá, chanh sần và bưởi Citrus grandis (Chỉ dùng cho các giống bưởi
Pomelo) làm gốc ghép.
Lấy hạt từ quả tươi sau đó rửa sạch thịt quả. Tách bỏ lớp vỏ ngoài của hạt và bảo quản
trong giấy lọc ẩm đến khi đem ra sử dụng. Khử trùng bề mặt hạt trong dung dịch Clorin
0,5 % hoặc Sodium hypochlorite (Có chứa 1% clo) trong 10 phút. Sau đó rửa kỹ trong
nước đã tiệt trùng tối thiểu 3 lần. Đưa hạt vô trùng vào trong môi trường Agar sạch để
trong buồng cấy, sau đó đưa vào tủ ấm ở 26 oC trong bóng tối.
Nếu hạt không dùng ngay sau khi đã tách khỏi quả, ta phơi trên giá đỡ. Hạt được tiệt
trùng bề mặt và được bảo quản bằng cách nhúng trong dung dịch Clorin 1 % hoặc
Sodium hypochlorite. Sau đó tiến hành làm như đối với hạt tươi.
Sau 4 - 5 ngày hạt sẽ mọc. Chuẩn bị những ống nghiệm để trồng cây giữ trong môi
trường đồng nhất có chứa môi trường hỗn hợp Murshige và Skoog + đường + agar, tiệt
trùng ở 121oC trong 20 phút. Đặt hạt nảy mầm lên bề mặt agar trong các ống nghiệm
nuôi cấy khi chồi bắt đầu mọc.
Khi chồi ghép đạt đến độ dài thích hợp 3 - 4 cm, sau 10 - 12 ngày đưa những ống nghiệm
này vào trong buồng tối ở 4 - 7oC. Chọn các cây thẳng đưa vào buồng lạnh để ghép chồi
đỉnh. Thời gian lưu giữ cây con là một năm.
3.4 Ghép đỉnh sinh trưởng.
Ngâm dụng cụ trong cồn 70% khoảng 1 giờ trước khi dùng. Chuẩn bị các mẩu dao cạo và
tra vào cán. Nhúng dao cắt vào chất tẩy và sau đó làm sạch bằng cồn và hơ khô giữa mỗi
lần cắt. Không làm cháy lưỡi dao sau khi nhúng cồn. Thay đổi lưỡi dao khi chúng bị cùn.
Tiệt trùng bề mặt cành ghép trực tiếp khi đang ở trên cây bằng dung dịch Clorin 0,5 %
hoặc Sodium hypochlorite trong 5-10 phút, tuỳ thuộc vào điều kiện của cành ghép. Nếu
chúng đã được tiệt trùng và trồng trong cát, chúng có thể được sử dụng ngay. Nếu chúng
bị nhiễm bẩn thì đặt chúng trên vải màn và xử lý trong dung dịch Chlorin 0,01 % hoặc
Sodium hypochlorite trong 1 phút sau đó rửa cẩn thận 3 lần trong nước lọc.
Cắt tỉa lá mầm và chồi bên, mở vết ghép hình chữ T và tiến hành ghép.
Loại bỏ hết lá ở cành ghép để lộ mô phân sinh. Sử dụng một lưỡi dao cho một mô phân
sinh. Đặt mô phân sinh lên vết ghép và đóng nắp vết ghép lại. Đặt cây con trong giấy lọc
và trồng trong ống nghiệm có hỗn hợp môi trường Murshige và Skoog + đường + muối
sắt hoà tan + White's vitamin. Xử lý môi trường ở nhiệt độ 121oC trong 10 phút.
Giữ cây con ở nhiệt độ 28 oC với chu kỳ chiếu sáng là 16 giờ. Chăm sóc cây tối thiểu 4 -
6 tuần hoặc có thể dài hơn. Cây con có thể cần được cắt tỉa mầm ở giai đoạn sinh trưởng
trong ống nghiệm và có thể chuyển vào môi trường mới .
3.5. Chuyển cây con đã được ghép đỉnh sinh trưởng ra khỏi ống nghiệm.
Sau 4 - 6 tuần, khi mắt ghép đã mọc chồi được 1 cm cùng với 2 lá, đưa cây con ra khỏi
ống nghiệm, tỉa bớt rễ và trồng cây trong chậu có chứa hỗn hợp chất độn. Giữ cây trong
điều kiện ánh sáng yếu trong tuần đầu tiên. Duy trì ẩm độ cao trong vài ngày đầu bằng
cách dùng tấm nhựa che phủ cây con. Khi cây cứng cáp ta loại bỏ dần tấm nhựa che phủ.
Có thể sử dụng các biện pháp tương tự như trên nếu thấy mắt ghép còn xanh nhưng chưa
phát triển. Hàng ngày tưới 2g/l Ca(NO3)2. Kiểm tra các dòng ghép để khẳng định đã loại
bỏ hết các bệnh.
3.6. Mụi truờng nuụi cấy. Các hợp chất Hàm lượng
Môi trường
Rắn Lỏng
Dung dịch muối cơ bản KNO3 1,90 g/l 1,90 g/l
Murashige & Skoog NH4NO3 1,65 g/l 1,65 g/l
CaCl2.2H2O 440 mg/l 440 mg/l
MgSO4.7H2O 370 mg/l 370 mg/l
KH2PO4 170 mg/l 170 mg/l
MnSO4.H2O 16,9 mg/l 16,9 mg/l
ZnSO4.7H2O 8,6 mg/l 8,6 mg/l
H3BO3 6,2 mg/l 6,2 mg/l
Kl 0,82 mg/l 0,82 mg/l
Na2MoO4.2H2O 0,25 mg/l 0,25 mg/l
CuSO4.5H2O 0,025 mg/l 0,025 mg/l
CoCl2.6H2O 0,025 mg/l 0,025 mg/l
Muối sắt hoà tan Na2-EDTA - 37,3 mg/l
FeSO4.7H2O - 27,8 mg/l
Một số chất khác Myo-I-Inositol - 37,3 mg/l
Nicotinic - 27,8 mg/l
Pyridoxine - 100,0 mg/l
Thiamine HCl - 1,0 mg/l
Đường Sucrose 30 g/l 1,00,2 mg/l
Agar Agar 10 g/l 75 g/l
PHỤ LỤC
KIỂM DỊCH THỰC VẬT SAU NHẬP KHẨU
1. Kiểm tra Kiểm dịch Sau nhập khẩu.
Bảng 1. Các phương pháp kiểm tra.
Phản ứng chuỗi Polymerasa Sử dụngchẩn đoán một số loại bệnh
ẩn.
Men liên kết miễn dịch
Citrus tristeza closterovirus ( Virus
tàn lụi cam quýt)
Xylella fastidiosa
Spiroplasma citri
Satsuma dwarf ilarvirus (Virus lùn
Satsuma)
Citrus tatter leaf capillovirus (Virus
nhỏ lá cam quýt)
Chỉ thị sinh học
Các loài Các giống cây chỉ thị
Citrus sinensis
Maltese Blood or Ruby
Blood
Psorosis complex (Tổ hợp Virus bệnh
đốm)
(Cam)
Spiroplasma citri
Liberobacter asiaticum
Liberobacter africanum
Citrus limon
Lambert Eureka (Chanh
Eureka)
Citrus tristeza closterovirus, yellows
strain (Virus tàn lụi cam quýt)
(Chanh)
Citrus leaf rugose virus (Virus quăn
lá cam quýt)
Citrus variegation ilarvirus
Citrus medica L.
(Chanh yên)
Etrog (Chanh Yên)
Citrus exocortis viroid (Viroid vẩy
vỏ)
Citrus aurantifolia
West Indian lime
(Chanh Tây ấn)
Citrus tristeza closterovirus-stem
pitting strain (Virus tàn lụi cam quýt)
(Quýt)
Citrus veinenation virus (Virus biến
dạng gân lá)
Poncirus trifoliata X
C. sinensis
Rusk or Swingle,
Citrange (Rusk or
Swingle chanh)
Citrus tatter leaf capillovirus (Nhỏ lá
cam quýt)
1.1. Phương pháp PCR.
Mỗi loài sinh vật có cấu trúc DNA khác nhau và trong cùng một giống giữa các loài cũng
có sự khác nhau. Trong một giống, DNA của các loài có những đoạn cấu trúc giống nhau,
Không có nhận xét nào:
Đăng nhận xét